|
|
Reactive modifications of RNA for bioconjugations with proteins and new enzymatic methods for the synthesis of base-modified RNA
Brunderová, Mária ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent) ; Vaňáčová, Štěpánka (oponent)
Tato disertační práce je zaměřena na enzymovou syntézu na bázi modifikovaných RNA s různými funkčními skupinami, včetně reaktivních pro síťování proteinů, hydrofobních a fluorescenčních skupin nebo afinitních značek. Konstrukce oligonukleotidů modifikovaných na bázi je zabezpečena buď konvenční in vitro transkripcí s T7 RNA polymerázou, nebo inovativním přístupem využívajícím upravené mutantní DNA polymerázy a reakci prodlužování primerů (PEX). V první části práce byl nasyntetizován nový ribonukleosid trifosfátový stavební blok s reaktivní chloracetamidovou funkční skupinou pomocí Sonogashirovy kaplingové reakce ve vodní fázi katalyzované Pd, přímo aplikované na jodovaný nukleotid. Chloracetamidem modifikovaný trifosfát byl poté testován jako vhodný substrát pro in vitro transkripci s T7 RNA polymerázou s cílem zkonstruovat RNA sondy s jednou nebo více reaktivními skupinami. Selektivita chloracetamidem modifikovaných RNA pro thiol, nebo cystein a histidin obsahující (bio)molekuly byla ukázána modelovými biokonjugačními reakcemi a experimenty pro síťování se třemi RNA-vazebnými proteiny s různými strukturami a funkcemi. Účinná tvorba kovalentních RNA-protein aduktů byla potvrzena western blotem, gelovou elektroforézou a hmotnostní analýzou, které byly prováděny za denaturačních podmínek....
|
|
|
Modified nucleotides and DNA for electrochemical labelling and defined display of small molecules
Krömer, Matouš ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Křen, Vladimír (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent)
Souhrn Tato práce je zaměřena na enzymatickou syntézu sond pro elektrochemické značení, biokonjugace a ve své závěrečné kapitole, postavené na poznatcích získaných v předchozích částech, popisuje metodu pro přípravu vysoce funkcionalizované DNA modifikované na bázích, využitelnou pro kontrolovanou multivalentní prezentaci glykosidů. V první částí byla nalezena metoda pro přípravu nukleotidů nesoucích diolové skupiny. Sonogashirova reakce umožnila přístup k diolům připojeným přes alkynovou spojku, následná katalytická hydrogenace, poprvé popsána v literatuře, poté poskytla cestu k diolům připojeným přes flexibilní sp3 hybridizovanou spojku, a to bez použití chránících skupin. Štěpení diolů připojených k nukleotidům přes sp3 spojku, nikoliv však přes alkynovou spojku, vedlo ke vzniku nukleotidu modifikovaného alifatickým aldehydem. Všechny nukleotidy byly dobrými substráty pro KOD XL DNA polymerázu, jak v reakci extenze primeru, tak v polymerázové řetězové reakci, vyjma aldehydem modifikovaného dUTP, který byl akceptován v PEX, ale produkty PCR reakce vznikaly pouze ve směsích s přirozeným dTTP. Toto omezení bylo překonáno štěpením diolů až po inkorporaci do DNA, čímž také vznikla DNA modifikovaná aldehydovými skupinami. Všechny reaktivní sondy byly použiti pro biokonjugace s fluorescenčním hydrazeinem, pro...
|
|
|
Novel fluorescent nucleotides for metabolic labelling and for the construction of DNA probes
Kuba, Miroslav
Cílem této dizertační práce byla syntéza nových nukleosidů, nukleotidů a příslušných DNA sond nesoucích různé fluorescenční značky pro bioanalytické aplikace. V první části práce byl pomocí Sonogashiry cross-kapling reakce syntetizován 2'-deoxycytidin a jeho trifosfát nesoucí imidazolinový fluorofor na bázi tryptofanu. Daný fluorofor vykazoval citlivost na pH a viskozitu. Nukleotid byl použit pro konstrukci modifikovaných oligonukleotidů (ON) a DNA prodlužováním primeru (PEX) nebo polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Značená ON sonda byla použita pro snímání interakce se single-strand vazebným proteinem, což vedlo ke zvýšení intenzity fluorescence modifikovaného ON. Dále byl připraven thymidin a thymidin-5'-O-trifosfát, nesoucí benzyliden- tetrahydroxanthyliový fluorofor, pomocí mědí katalyzované azid-alkynové cykloadice (CuAAC). Fluorescence fluoroforu je závislá na polaritě a viskozitě prostředí. Inkorporace modifikovaného nukleotidu do DNA pomocí PEX nebo PCR vedlo k dramatickému zvýšení fluorescence, pravděpodobně díky interakcím fluoroforu ve velkém žlábku. Bohužel, modifikovaný nukleotid nebyl vhodný pro vizualizace v buňkách kvůli své cytotoxicitě. Modifikovaná dsDNA byla použita jako fluorescenční sonda pro snímání interakcí s malými molekulami a proteiny změnou fluorescence. Nakonec byl...
|
|
|
Bioorthogonal reactions on DNA for regulation of transcription
Chakrapani, Aswathi ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Zimčík, Petr (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent)
Souhrn Tato disertační práce popisuje návrh a syntézu derivátů nukleotidů a DNA nesoucích fotolabilní nebo glukosylované modifikace připojené k epigenetické značce 5-(hydroxymethyl)pyrimidinu, pomocí chemických a enzymatických metod a dále studium regulace genové exprese na bakteriální (Escherichia coli RNA polymeráza) in vitro transkripční úrovni. V první části práce je popsán design a syntéza 5-nitrobenzyloxymethyl-2'-deoxyuridinových (dUNB) a -cytidinových (dCNB) fosforamiditů. Tyto nukleosidové fosforamiditové stavební bloky chráněné fotolabilní skupinou byly použity při automatizované syntéze oligonukleotidů (ONs) na pevné fázi modifikovaných ve specifických polohách. ONs byly následně použity jako přímé primery v polymerázové řetězové reakci (PCR) pro konstrukci dUNB- a dCNB-modifikovaných DNA templátů v konkrétních pozicích promotorové oblasti. Značená DNA byla poté v této oblasti ozářena světlem, které způsobilo uvolnění NB-skupin a vedlo ke vzniku odpovídajících specifických míst nesoucích volnou 5-(hydroxymethyl)ovou (5hm) modifikaci. Následně byly provedeny bakteriální in vitro transkripční studie modifikované i přirozené DNA. Inkorporace epigenetických pyrimidinových nukleotidů dUNB a dCNB nesoucích fotosenzitivní chránící skupiny do promotorové oblasti (-35) templátové DNA vedla k částečné...
|
|
|
Modifications of DNA by reactive groups for bioconjugations and cross-links with arginine-containing peptides and proteins
Leone, Denise Liu ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Urban, Milan (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent)
SOUHRN Tato disertační práce popisuje vývoj a syntézu DNA-reaktivních vláken nesoucích 1,3-diketonové nebo fenylglyoxalové části, které lze použít pro spojování s peptidy nebo proteiny obsahujícími arginin. Obecná strategie byla založena na funkcionalizaci polohy 5 u pyrimidinů prostřednictvím vodné Sonogashirovy reakce nebo click reakce (CuAAC) s reaktivními stavebními bloky pro syntézu modifikovaných 2'-deoxyribonukleosid monofosfátů a trifosfátů (dNMP/dNTPs). Následujícím krokem bylo enzymatické začlenění takto funkcionalizovaných dNTPs do DNA prostřednictvím metody prodlužování primeru (PEX). Paralelně byly monofosfátové deriváty použity jako modelové sloučeniny pro reakce s argininem a peptidy obsahujícími arginin pro testování reaktivity na vláknech DNA. Pro reaktivní kandidáty byly provedeny modelové reakce na modifikované DNA s argininem nebo peptidy obsahujícími Arg a následně byly DNA vlákna použity v reakcích s DNA-vazebnými proteiny bohatými na Arg. Vývoj takových vláken DNA nebyl přímočarý, ale vyžadoval zkoumání různých kandidátů. Nejdůležitějším bodem a zároveň výzvou při návrhu reaktivních stavebních bloků bylo nalezení rovnováhy mezi reaktivitou a stabilitou reaktivní skupiny. Prvním kandidátem byla glyoxylamidová skupina maskovaná thiazolidinem. Bohužel se ukázalo, že tento kandidát je...
|
|
|
Novel fluorescent nucleotides for metabolic labelling and for the construction of DNA probes
Kuba, Miroslav ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Slanina, Tomáš (oponent) ; Míšek, Jiří (oponent)
Cílem této dizertační práce byla syntéza nových nukleosidů, nukleotidů a příslušných DNA sond nesoucích různé fluorescenční značky pro bioanalytické aplikace. V první části práce byl pomocí Sonogashiry cross-kapling reakce syntetizován 2'-deoxycytidin a jeho trifosfát nesoucí imidazolinový fluorofor na bázi tryptofanu. Daný fluorofor vykazoval citlivost na pH a viskozitu. Nukleotid byl použit pro konstrukci modifikovaných oligonukleotidů (ON) a DNA prodlužováním primeru (PEX) nebo polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Značená ON sonda byla použita pro snímání interakce se single-strand vazebným proteinem, což vedlo ke zvýšení intenzity fluorescence modifikovaného ON. Dále byl připraven thymidin a thymidin-5'-O-trifosfát, nesoucí benzyliden- tetrahydroxanthyliový fluorofor, pomocí mědí katalyzované azid-alkynové cykloadice (CuAAC). Fluorescence fluoroforu je závislá na polaritě a viskozitě prostředí. Inkorporace modifikovaného nukleotidu do DNA pomocí PEX nebo PCR vedlo k dramatickému zvýšení fluorescence, pravděpodobně díky interakcím fluoroforu ve velkém žlábku. Bohužel, modifikovaný nukleotid nebyl vhodný pro vizualizace v buňkách kvůli své cytotoxicitě. Modifikovaná dsDNA byla použita jako fluorescenční sonda pro snímání interakcí s malými molekulami a proteiny změnou fluorescence. Nakonec byl...
|
|
|
Analýza adenosintrifosfátu a adenosindifosfátu pomocí HPLC-MS/MS
Černá, Martina ; Coufal, Pavel (vedoucí práce) ; Bosáková, Zuzana (oponent)
V této bakalářské práci byly analyzovány a detekovány vzorky adenosindifosfátu a adenosintrifosfátu pomocí metody HPLC-MS/MS. V rámci tohoto bakalářského projektu byly nalezeny orientační limity detekce (LOD) studovaných látek a tyto hodnoty byly porovnány s LOD zjištěnými v literatuře při použití stejných metod a velmi podobných experimentálních podmínek. Stanovené limity detekce nukleotidů byly srovnatelné s limity detekce v literatuře. Analýza pomocí hmotnostní spektrometrie byla prováděna při mnohonásobném reakčním monitorování v pozitivním i negativním módu a k ionizaci analytů došlo elektrosprejem. Optimálních podmínek pro analýzu ADP a ATP pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie bylo dosaženo použitím kolony ZIC - HILIC s mobilní fází o složení 75:25 (v/v) acetonitril / 10 mM octan amonný. Octan amonný měl pH nastavené na hodnotu 7,15 a dělení probíhalo při izokratické eluci.
|
|
|
Příprava a enzymatická inkorporace deoxyribonukleosid trifosfátů odvozených od pyrimido[4,5-b]indolu do DNA pomocí vybraných polymeras
Bosáková, Andrea ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá syntézou pyrimido[4,5-b]indolových 2'- deoxynukleosidů a jejich následnou trifosforylací. Celkem byly připraveny tři nové analogy 2'-deoxyadenosin trifosfátu s anelovaným benzenovým jádrem. Dále byla zkoumána schopnost vybraných DNA polymeras inkorporovat celkem čtyři modifikované 2'-deoxyribonukleotidy do oligonukleotidového řetězce pomocí tzv. primer extension (PEX) metody. Všechny modifikované 2'- deoxyribonukleotidy byly inkorporovány do oligonukleotidového řetězce, avšak úspěšnost následné elongace se lišila v závislosti na použité DNA polymerase a substituentu v poloze 6 ve struktuře substrátu. (In Czech) Klíčová slova nukleosidy, modifikované nukleotidy, DNA polymerasy, PEX reakce
|
|
|
Stanovení adenosintrifosfátu a adenosindifosfátu v reálných vzorcích
Černá, Martina ; Coufal, Pavel (vedoucí práce) ; Zima, Jiří (oponent)
Úkolem tohoto diplomového projektu bylo nalézt vhodné podmínky pro stanovení dvou běžných nukleotidů adenosindifosfátu a adenosintrifosfátu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie a provést jejich analýzu v reálných vzorcích citrusových plodů a extraktů z rostlin. Dalším cílem bylo zjistit limity detekce a stanovení obou nukleotidů při těchto optimalizovaných podmínkách měření a pomocí těchto limitů porovnat citlivost používaných detektorů. K zjištění zkoumaných nukleotidů byly využity instrumentace HPLC-UV, kapilární HPLC-DAD a HPLC-MS. Pomocí HPLC s UV detekcí a kapilární HPLC s detektorem diodového pole byly proměřeny kalibrační závislosti směsi analytů a určeny limity detekce a stanovení adenosindifosfátu a adenosintrifosfátu. K rozdělení analytů až na základní linii pomocí HPLC-UV a kapilární HPLC-DAD došlo za podmínek iontově párové chromatografie. Vhodnou kolonou byla kolona C18. Mobilní fáze obsahovala fosfátový pufr, acetonitril a tetrabutylamonium bisulfát jako iontově párové činidlo. Dělení probíhalo při gradientové eluci. U LC-MS byly zjišťovány podmínky analýzy ADP a ATP. Při vysokoúčinné kapalinové chromatografii s hmotnostní detekcí bylo dosaženo rozdělení analytů na koloně C18, fenyl-hexylové koloně a koloně Zic HILIC. Mobilní fáze protékající kolonou C18 obsahovala 99:1 (v/v)...
|
|
|
Vývoj nové metody analýzy nukleotidového fondu v bakteriálních buňkách
Zborníková, Eva ; Rejman, Dominik (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Kozlík, Petr (oponent)
(CZ) Předkládaná dizertační práce se zabývá stanovením nukleotidů v bakteriálních buňkách. Nukleotidy hrají klíčovou úlohu ve většině metabolických dějů, a proto informace o jejich zastoupení je důležitým vodítkem o vlivu interních i externích podmínek na látkovou přeměnu bakterií. Dosud publikované práce zabývající se analýzou nukleotidů a jiných intracelulárních metabolitů lze rozdělit na dvě skupiny podle používané techniky: a) práce s metabolomickým přístupem a b) práce s úzkou skupinou cílových analytů pro rutinní analýzu. V případě a) většinou autoři využívají nejmodernější techniky LC-MS/MS, v případě b) robustní UV detekci nejčastěji ve spojení s IP-LC. Cílem této práce bylo spojit oba přístupy a získat metodu pro rutinní analýzu, která by ale využívala benefitů hmotnostní detekce, jako je citlivost a selektivita, a zároveň by nevyžadovala náročné optimalizování MS/MS přechodů a odbornou obsluhu. Hlavní záměr nové HILIC-MS metody je její univerzální aplikovatelnost ve většině biologických a biochemických laboratoří.
|
host ::
RSS.